Die Fähigkeit, die Aminosäuresequenz von Proteinen in definierter Art zu verändern, ist für die heutigen Lebenswissenschaften von zentraler Bedeutung. Aus dem Bereich der Molekularbiologie sind die entsprechenden Methoden, wie die ortsgerichtete Mutagenese, die bei ihrer Einführung eine wahre Revolution auslöste, nicht mehr wegzudenken. In jüngster Zeit treten jedoch mehr und mehr die Limitierungen dieser molekularbiologischen Methoden zum Vorschein, die in der begrenzten chemischen Diversität der 20 proteinogenen Aminosäuren liegen. Viele Fragen bezüglich der Funktionsanalyse von Proteinen als auch deren biotechnologische Instrumentalisierung bedürfen einer chemischen Vielfalt, die die der kanonischen Aminosäuren des ribosomalen Codes übersteigt. Die Natur selbst erweitert die chemische Vielfalt ihrer Proteine durch eine Vielzahl von posttranslationalen Proteinmodifikationen, was beispielsweise durch die Glycosylierung oder Phosphorylierung bestimmter Aminosäurereste erfolgt.1 Solche Modifikationen sind für die Regulierung von biologischen Prozessen, wie z.B. der molekularen Steuerung von Signalketten und Protein-Protein Interaktionen, der Stabilisierung von Proteinen oder für die Ausbildung spezifischer Proteinstrukturen verantwortlich.2 Störungen in der Biosynthese modifizierter Proteine werden mit verschiedenen Krankheiten wie z.B. Carcinogenese oder Diabetes assoziiert.
Genauere proteomische Funktionsstudien, die den Einfluss von Proteinmodifikationen auf Struktur und Funktion in biologischen Systemen erörtern, stellen jedoch eine große Herausforderung für die Lebenswissenschaften dar, da modifizierte Proteine durch rein molekularbiologische Methoden nicht oder nur sehr schwer zugänglich sind. Erschwerend für Forschungen in diesem Bereich ist auch die schwierige Isolierung und Reinigung modifizierter Proteine aus natürlichen Quellen, da diese Proteine oftmals als heterogene Mischung mit verschiedenen Proteinmodifikationen vorliegen. Ebenso hinderlich ist die Tatsache, dass die modifizierenden Enzyme bzw. mögliche Interaktionspartner, die diese Modifikationen erkennen, häufig selbst unbekannt sind und deren Identifikation ebenfalls Gegenstand umfangreicher Forschungsbemühungen ist.3 Von daher werden synthetische Verfahren, mit denen modifizierte Proteine dargestellt werden können, als wichtige Werkzeuge für die Lebenswissenschaften angesehen. Dadurch hat die Synthese von modifizierten Proteinen besondere Aufmerksamkeit erlangt. Es hat Wissenschaftler/innen ermöglicht, das Gebiet der Proteomanalyse entscheidend voranzubringen, indem sie die Lokalisation und die Funktion von post- bzw. cotranslational modifizierten Proteinen studieren konnten.4
Ein zentraler Bestandteil der Forschungsbemühungen auf dem Gebiet der Proteinsynthese richtet sich auf die Entwicklung von chemoselektiven Ligations- und Modifikationsstrategien, die entweder rein chemisch oder enzymatisch ablaufen können, sowie auf der Entwicklung biochemischer Verfahren zur Darstellung von Proteinfragmenten, die in den Protein-Syntheserouten eingesetzt werden können.3 Diese kombinierten chemischen und biochemischen Prozesse erlauben einen selektiven Einbau natürlicher, modifizierter (beispielsweise phosphorylierter oder glycosylierter) Aminosäuren oder die Einführung biophysikalischer Sonden in komplexe Biomoleküle.5
Schema 1: Methodische Ansätze und Anwendungen der chemoselektiven Proteinsynthese
Schema 1 verdeutlicht das methodische Fundament, auf dem das Gebiet der chemoselektiven Proteinsynthese aufbaut. Hierbei lassen sich die im Folgenden ausführlicher betrachteten vier methodischen Unterbereiche identifizieren, die miteinander kombiniert werden können und so zur Darstellung verschiedener komplexer Proteine beitragen (s. 1.1.1-4).
Chemische Ligationsstrategien in der Proteinsynthese setzen sich meistens aus einem chemoselektiven capture-Schritt, der zwei Peptidfragmente miteinander verknüpft, und einer sich daran anschließenden intramolekularen Umlagerung (rearrangement) zusammen. Dieses sogenannte capture/rearrangement Verfahren bildet auch die Grundlage für die am häufigsten in der Proteinsynthese verwendete Ligation, der Nativen Chemischen Ligation (NCL). Die NCL wurde, basierend auf ersten Beobachtungen von T. Wieland,6 erstmals 1994 von Kent et al. als chemoselektives Verfahren für die Verknüpfung von einem ungeschützten Peptid-Thioester mit einem ungeschützten N-terminalen Cys-Peptid beschrieben, bei der eine native Amidbindung an einer Cys-haltigen Ligationsstelle entsteht (Schema 2).7 Dabei bildet sich zunächst in einer reversiblen Transthioesterifizierung (capture) ein Thioester, der anschließend durch einen S→N Shift zum intermolekular verknüpften Peptid umlagert (rearrangement). In den letzten Jahren wurde die NCL besonders im Hinblick auf eine allgemeine Reaktionsführung optimiert, die auch Ligationen an anderen, nicht-Cys-haltigen Ligationsstellen erlaubt. Solche Verfahren greifen entweder auf Thiol-haltige Auxiliare zurück, die nach der Ligation entfernt werden, oder verwenden chemische Transformationen des Cysteins an der Ligationsstelle, wie beispielsweise in der Desulfurisierung zu Ala oder in Alkylierungsreaktionen. Alternativ wurden auch neue capture-Schritte durch chemoselektive Reaktionen beschrieben, wie anhand der spurlosen Staudinger Ligation demonstriert. Schließlich wurden auch verschiedene neue Syntheserouten zu Peptidthioestern sowie, basierend auf dem Zugang von Thioestern unterschiedlicher Elektrophilie, konvergente Strategien für die Ligation multipler Peptidfragmente entwickelt, wie sie beispielsweise in der kinetisch kontrollierten Ligation verwirklicht wurden.
Schema 2: Native Chemische Ligation und semisynthetische Varianten
Die NCL findet nicht nur Anwendung in der Ligation synthetischer Peptide sondern auch in der Protein Semisynthese, bei der synthetische Peptide mit biotechnologisch produzierten, rekombinanten Proteinfragmenten verknüpft werden (Schema 2). In diesem Zusammenhang eignet sich die NCL besonders für den ortsspezifischen Einbau biophysikalischer Sonden oder modifizierter Aminosäuren, da der capture/rearrangement Prozess durch die natürliche Aminosäure Cystein vermittelt wird.8 Um einen synthetischen Thioester mit einem rekombinanten Protein zu ligieren, benötigt letzteres ein N-terminales Cys, das üblicherweise durch eine Kombination ortsgerichteter Mutagenese und kontrollierter Hydrolyse mit Proteasen bewerkstelligt wird. Erfolgreiche Synthesen durch die NCL oder die verwandte exprimierte Protein Ligation (expressed protein ligation, EPL), bei der Protein-Thioester rekombinant erzeugt werden, schließen eine Vielzahl von Proteinen ein, beispielsweise Membranproteine, zyklische Proteine, Proteine mit unnatürlichen biophysikalischen Sonden oder photolabil-geschützten Funktionalitäten („caged proteins“) sowie Proteine mit natürlichen posttranslationalen Modifikationen in phosphorylierten, lipidierten, ubiquitylierten, acetylierten, sulfatierten und glycosylierten Proteinen.3 Besonders zwei kürzliche Synthesen von Glycoproteinen, der Synthese homogen glycosylierter RNAse9 und eines Prion-Proteins mit GPI-Anker,10 liefern eindrucksvolle Beispiele für erfolgreiche Semi-Synthesen deutscher Arbeitsgruppen.
Chemoselektive Reaktionen haben Forscher in die Lage versetzt, nicht nur homogene natürliche bzw. modifizierte Proteine durch Ligation von Peptidsträngen herzustellen (siehe 1.1.1.) sondern auch funktionale Module, wie natürliche Proteinmodifikationen oder Label, in Proteinarchitekturen einzubauen.4,5 In diesem Verfahren werden Proteine oder andere biologisch relevante Biopolymere, die eine unnatürliche funktionelle Gruppe tragen, als Substrate für nachfolgende chemoselektive bzw. bioorthogonale Reaktionen11 eingesetzt, die diese unnatürliche funktionelle Gruppe selektiv umsetzen (Schema 3; zur Diskussion chemoselektiver Reaktionen siehe 1.1.3).12 Eine Anwendung dieses Verfahrens erlaubt beispielsweise die Lokalisation posttranslational modifizierter Proteine in lebenden Organismen. Dazu wird in der sogenannten “bioorthogonalen chemischen Reporterstrategie” eine biophysikalische Sonde an eine unnatürliche funktionelle Gruppe in einem Biopolymer konjugiert, die vorher durch den zellulären biosynthetischen Apparat eingeführt wurde.4
Schema 3: Ortsspezifische Proteinmodifikation durch rekombinanten Einbau unnatürlicher Aminosäuren und anschließende chemoselektive Modifikation
Für den Einbau unnatürlicher funktioneller Gruppen X (Schema 3) gibt es derzeit verschiedene rekombinante Methoden. Zu diesen zählt der Einbau unnatürlicher Gruppen über zelluläre Biosynthese, wie beispielsweise das metabolische Glycanengineering, durch den unnatürliche Kohlenhydrate in Glycoproteine eingebaut werden können.4a,13
Weitere Verfahren von besonderer Wichtigkeit für das SPP sind die Proteinexpression mittels Auxotroph-Expression (genetisches Codeengineering)14 und die unnatürliche Proteintranslation (genetische Codeerweiterung) über das Amber-Suppressions-Verfahren.15 Das genetische Codeengineering erlaubt den Aminosäurespezifischen Austausch einer bestimmten Aminosäure in der Proteinsequenz, ohne dass eine DNA-Mutagenese notwendig ist. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Methode des „erweiterten genetischen Codes" den ortsspezifischen Einbau von synthetischen Aminosäuren in einzelne rekombinante Proteine mit Hilfe von gentechnisch veränderten Komponenten der translationalen Maschinerie.16
Bis jetzt waren beide Methoden auf eindimensionale Optimierungen beschränkt, da lediglich eine Art von synthetischen Aminosäuren pro Zielprotein eingebaut werden konnte. Dabei wurden entweder die biophysikalischen Eigenschaften eines bestimmten Proteins verändert, z. B. Fluoreszenz und Faltungsverhalten, oder, wie oben beschrieben, bio-orthogonale Gruppen chemisch modifiziert. Jüngst konnte bei beiden Verfahren (oder auch durch ihre Kombination) gezeigt werden, dass gleichzeitige Doppel- und Dreifachersetzungen durch chemisch unterschiedliche synthetische Aminosäuren möglich sind.17 Ebenso können mit Suppressionsverfahren auch direkt biologisch relevante posttranslational modifizierte Aminosäuren, wie Acetyllysin, eingebaut werden.18 Damit wird die Zusammenfassung vieler experimenteller Schritte in ein einziges Expressionsexperiment möglich.
Chemoselektive bzw. bioorthogonale Reaktionen können selektiv unnatürliche funktionelle Gruppen, die durch die in Abschnitt 1.1.2. beschriebenen Methoden ortsspezifisch in Proteine eingebaut wurden, in einem Biomolekül adressieren, während die anderen natürlich vorkommenden funktionellen Gruppen unangetastet bleiben.11 Eine neben der Chemoselektivität wichtige Anforderung an solche Transformationen ist die Notwendigkeit einer schnellen Reaktion, die unter physiologischen Bedingungen (Wasser, hohe Salzkonzentrationen, reduzierende Bedingungen, keine Verwendung toxischer Additive) ablaufen soll. Neben Ketonen, die in die entsprechenden Oxim- oder Hydrazon-konjugate überführt werden können,19 haben sich besonders Azide als beliebte unnatürliche funktionelle Gruppe etabliert, die in verschiedenen chemoselektiven Reaktionen eingesetzt werden kann. Azide sind biologisch inert und es existieren viele biochemische Verfahren für den Einbau in Biomoleküle. Derzeit sind vier Verfahren für bioorthogonale Azid-Transformationen bekannt, wobei jeweils dipolare Cycloadditionen oder Staudinger-Reaktionen Verwendung finden.20
Die am häufigsten eingesetzte chemoselektive Azid-Reaktion ist die [3+2]-dipolare Cycloaddition mit Alkinen.21 Durch die Verwendung eines Cu(I)-Katalysators (“Click-Kupplung”, Schema 4A)22 oder den Einsatz von energiereichen Cyclooktin-Substraten in der “Spannungs-induzierten“ Cycloaddition (Schema 4B)23 führt diese Reaktion zu einem effizienten und schnellen Umsatz von Aziden zu Triazolen bei Raumtemperatur. Eine weitere Reaktion von Aziden stellt die sogenannte Staudinger Ligation dar (Schema 4C). Diese Reaktion beruht auf der chemoselektiven Bildung eines Iminophosphorans aus einem Phosphin, welches durch eine anschließende intramolekulare Acylierung mit einem Ester das Aza-Ylid elektrophil abfängt und somit eine konkurrierende Hydrolyse und P-N Spaltung (Staudinger-Reduktion) unterbindet.24 Kürzlich wurde eine Staudinger-Phosphit Reaktion für die Funktionalisierung von Proteinen angewandt, bei der Azide durch Umsetzung mit wasserlöslichen Phosphiten in Phosphoramidate überführt werden können (Schema 4D).25
Obwohl diese Transformationen weitreichende Applikationen in der chemischen Biologie ermöglicht haben,26 beispielsweise, einhergehend mit der Weiterentwicklung von Imaging-Verfahren, die Visualisierung aktiver Proteine in zellulären Systemen,27 so können dennoch individuelle Nachteile der Reaktionen eine generelle Einsetzbarkeit einschränken,20 die in zukünftigen Forschungsprojekten adressiert werden sollten. Diese Limitierungen entstehen beispielsweise durch die Toxizität der Cu(I)-Katalysatoren der sehr populären Click-Kupplung, die den Einsatz in vivo problematisieren, und durch die Komplexierung von Proteinen durch den Metallkatalysator, wodurch die Struktureigenschaften der Proteine verändert werden können. Cyclooktine für die metallfreie spannungsinduzierte Cycloaddition sind oftmals aufwendiger herzustellen und führen zu einer großen hydrophoben Modifikationseinheit zwischen der Sonde und dem Protein.28,29 Die Staudinger Ligation ist durch Oxidation des Phosphins und durch eine generell langsamere Reaktions-geschwindigkeit im Vergleich zu Cycloadditionen eingeschränkt. Die Staudinger-Phosphit Reaktion kann nur bei pH Werten > 7 eingesetzt werden, da ansonsten die Hydrolyse der Phosphite zu Phosphonaten einen hohen Überschuss an Phosphitreagenz verlangt.
Schema 4: Chemoselektive Reaktionen von Aziden: A) Click-Kupplung; B) Spannungs-induzierte Cycloaddition; C) Staudinger Ligation; D) Staudinger-Phosphit Reaktion
Chemoselektive Reaktionen konnten kürzlich von verschiedenen Arbeitsgruppen, insbesondere unter substantieller Beteiligung der Mitglieder des SPP, für die Modifizierung von Proteinen verwendet werden. Beispiele schließen eine chemische Glycosylierung in Form von Disulfid- oder Triazol-verbrückten Glycoproteinen,17b,30 eine chemische Phosphorylierung durch eine Staudinger-Phosphit Reaktion,25a eine Ubiquitylierung oder SUMOylierung von Proteinen31 und schließlich eine Lipidierung durch Michael-Addition eines Cys an eine Maleimidocaproyl-Einheit (MIC) ein.32 Besonders die letzte Studie ist in Ihrer Bedeutung für das Gebiet der Synthese funktionaler Proteine hervorzuheben, da es einem interdisziplinären Forschungskonsortium am MPI Dortmund durch Anwendung chemoselektiver Verfahren gelungen ist, die Rolle von Protein-Lipidierungen der Ras-Proteinfamilie in Signalprozessen nachzuweisen.33
Anstelle von rein chemischen Ligationsverfahren (siehe 1.1.1) gibt es auch effiziente enzymatische Alternativen, die wichtige Startmaterialien für Ligationen liefern oder die inhärente Chemoselektivität von Enzymen für die Verknüpfung von Peptiden ausnutzen.
Die bekanntesten Methoden nutzen Inteine für das Protein-trans-Spleißen (protein trans splicing). Teile des Spleiß-Prozesses bilden die Grundlage für die in 1.1.1 besprochene exprimierte Protein Ligation (EPL) und liefern die benötigten rekombinanten Thioester. Protein-Spleißen ist ein natürlich vorkommender Prozess bei dem sich eine als Intein bezeichnete Proteindomäne aus einem Vorläuferpolypeptid “herausschneidet“ und die flankierenden N- und C-terminalen Fragmente (Exteine) mit einer nativen Peptidbindung verknüpft.34 Dabei katalysiert das Intein selbst alle enzymatischen Reaktionen, die an diesem Prozess beteiligt sind. Interessanterweise findet man in der Natur neben den normalen Intein-Domänen auch solche, die in zwei Fragmente geteilt vorliegen. Diese Split-Inteine assoziieren zu einem funktionalen Komplex, der die Spleiß-Reaktion zwischen den flankierenden Polypeptiden katalysiert (Schema 5). In manchen Fällen lassen sich solche Split-Inteine auch durch die artifizielle Spaltung regulärer Intein-Domänen erhalten. Die Nutzbarkeit dieser Split-Inteine sei an dem Beispiel eines artifiziell gespaltenen Ssp-DnaB Intein erläutert: Das N-terminale Fragment dieses Split-Inteins umfasst nur 11 Aminosäuren und ist somit leicht synthetisch zugänglich. Verlängert man dieses N-terminale Inteinfragment (IntN) um weitere Reste werden diese chemoselektiv an ein Protein ligiert, das N-terminal um die C-terminale Hälfte des Split-Inteins (IntC) verlängert wurde.35 Präparative Vorteile der Split-Inteine für die Protein-Semisynthese liegen in den niedrigen erforderlichen Konzentrationen der beiden Reaktanden, der Vermeidung von besonderen funktionellen Gruppen und der möglichen Reaktionsdurchführung in lebenden Zellen.36
Schema 5: Protein-Spleißen für die Ligation von Peptiden
Ein weiteres wichtiges enzymatisches Verfahren beruht auf der Umkehr der Protease-katalysierten Peptidbindungsspaltung. Bei diesem als reverse Proteolyse bezeichneten Prozess werden die Proteasen selbst, die Reaktionsbedingungen oder die in der Ligation eingesetzten Edukte so manipuliert, dass die jeweiligen Proteasen als Protein-Ligasen fungieren. Dies lässt sich im einfachsten Fall dadurch verwirklichen, dass man die Reaktionen in organischen Lösungsmitteln ablaufen lässt, wodurch das Gleichgewicht zwischen Proteolyse und reverser Proteolyse zu Gunsten der reversen Proteolyse verschoben wird (thermodynamisch kontrollierte reverse Proteolyse). Die, bedingt durch hohe Konzentrationen an organischen Lösungsmitteln drastisch verringerten Enzymaktivitäten, setzten der praktischen Anwendung dieser thermodynamischen Reaktionsführung allerdings enge Grenzen. Bei der sogenannten kinetisch kontrollierten reversen Proteolyse, die sich insbesondere für die Semisynthese oder auch die selektive Modifizierung von Proteinen eignet, wird durch Verwendung aktivierter Peptidsubstrate künstlich eine Peptid-Protease Intermediat erzeugt, das bevorzugt unter Ligation mit einem anderen Peptid oder Protein abreagiert.37 Eine für die Ziele des SPP besonders wichtige in Deutschland entwickelte Anwendung der reversen Proteolyse ist die sogenannte „exprimierte enzymatische Ligation“ (expressed enzymatic ligation, EEL), die eine Kombination des Proteaseansatzes mit der EPL darstellt und erfolgreich für die Synthese des Pheromons Neuropeptid Y aus zwei Peptidfragmenten verwendet wurde.38
Als letztes Beispiel sei die Transpeptidase Sortase A angeführt, die von Natur aus Peptidligationen katalysiert und bereits erfolgreich in synthetischen Beispielen eingesetzt werden konnte. Um die Sortase A für Ligationen zu nutzen, muss allerdings das Peptid, das am N-Terminus des Ligationsproduktes auftauchen soll, über ein LPxTG Motiv am C-Terminus verfügen; zum anderen muss das C-terminale Peptid zumindest einen Gly-Rest am N-Terminus aufweisen.39 Nach der Zugabe der Sortase A wird das “sorting” Motiv des N-Peptides gespalten und danach mit dem N-terminalen Gly des C-Peptides verknüpft.
Neben zuvor diskutierten Anwendungen in der Ligation von Peptiden werden enzymatische Verfahren auch für die Modifikation von Proteinen, insbesondere für eine selektive Markierung mit Fluorophoren, sowie für die Proteinimmobilisierung verwendet. Eindrucksvolle Beispiele solcher enzymatischer Verfahren, die sich auch zu orthogonalen Funktionalisierungsstrategien kombinieren lassen,40 schießen den Snap-tag, bei dem ein Benzylguanin-Derivat durch die fusionierte O6-Alkylguanin-DNA-alkyltransferase (hAGT) kovalent mit dem Protein verknüpft wird,41 sowie den Halo-Tag mit ein, bei dem Chlorhexane durch Haloalkan-Dehalogenasen
konjugiert werden.42
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