Proteinchemische Analytik (Peptid-Massenspektrometrie und
Edman-Sequenzierung)
Neben den einschlägigen Methoden zur Protein- und Peptidreinigung
verfügt unsere Abteilung über modernste Proteinanalytik:
- Peptidmassenspektrometrie (Dr.Peter Franke/ Dr.Mathias Dreger):
MALDI-MS (Bruker Reflex) und ESI-MS (Finnigan MAT triple stage quadrupole
TSQ 700). Mit beiden Techniken ist auch Peptidsequenzierung (CID und PSD)
möglich.
- Chemische Protein-Mikrosequenzierung nach Edman (Dr.Chris Weise):
ABI 473A Proteinsequenzer
Vorrangig sind in jedem Fall die Analysen für unsere
eigenen Projekte. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit
zur wissenschaftlichen Kooperation mit anderen Arbeitsgruppen (siehe auch
weiter unten). Wir verstehen uns jedoch nicht als Servicegruppe
und sind keine kommerziellen Dienstleistungs-Anbieter.
Ansprechpartner: Dr.
Chris Weise, Tel. 030-838 56424
Einige Anwendungbereiche:
- Eine Standardanwendung ist die Identifizierung von Proteinen durch
Massen-Fingerprints.
Bei dieser Methode werden die zu identifizierenden Proteine zunächst
im SDS-Gel aufgetrennt; die Proteine werden dann im Gel ("in situ") mit
Trypsin verdaut und es wird mit MALDI-MS ein Massenspektrum des erzeugten
Peptidgemisches aufgenommen. Danach erfolgt ein Abgleich der experimentell
ermittelten Massendaten mit der Protein-Datenbank ("in silico-Spaltung").
Die Methode ist sehr zuverlässig und eignet sich besonders für
Organismen, für die bereits zahlreiche Proteinsequenzen bekannt sind
oder gar das gesamte Genom sequenziert ist. Die Identifizierung kann nötigenfalls
durch die MS-Sequenzierung einzelner Peptide abgesichert
werden. - Massen-Fingerprints sind Grundlage der Proteom-Forschung, wo
der Gesamtbestand an Proteinen in bestimmten Subkompartimenten erfasst
werden soll (1).
Häufig werden Teilsequenzen als Grundlage für Klonierung unbekannter
Proteine benötigt. Solche Sequenzen können z.B. durch die N-terminale
Sequenzierung vom Blot gewonnen werden. Blotproben zur Sequenzierung
können mit Coomassie Blue oder Ponceau Rot angefärbt werden.
- N-terminal blockierte Proteine können durch Ermittlung interner
Sequenzen nach Spaltung im Gel und HPLC-Trennung der Peptide identifiziert
werden (13). In diesem Falle wird eine Ausgangsmenge von ca 200pmol angestrebt.
Die bei uns verwendete Kombination von MS und chemischer Sequenzierung
zur Peptidanalyse hilft, Daten von besonders hoher Qualität zu erzeugen.
Sie ist von speziellem Nutzen bei der Aufklärung posttranslationaler
(2, 6,11) oder chemischer Modifikationen (7,8) oder zur Charakterisierung
funktioneller Bereiche von Proteinen wie z.B. spezifischen Bindungsstellen
(3,9,12).
Ausgesuchte Publikationen:
-
Aus unserer Arbeitsgruppe:
-
(1) Dreger, M., Bengtsson, L., Schöneberg, T., Otto, H. and Hucho,
F. (2001) Nuclear Envelope Proteomics: Novel Integral Membrane Proteins
of the Inner Nuclear Membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
11943-48.
-
(2) Otto, H., Dreger, M., Bengtsson, L. and Hucho F (2001) Identification
of tyrosine-phosphorylated proteins associated with the nuclear envelope,
Eur. J. Biochem. 268, 420-428.
-
(3) Bixel MG, Weise C, Bolognesi ML, Rosini M, Brierly M, Mellor IR, Usherwood
PNR, Melchiorre C, Hucho F. (2001) Location of the Polyamine Binding
Site in the Vestibule of the Nicotinic Acetylcholine Receptor Ion Channel,
J.Biol.Chem. 276, 6151-6160.
-
(4) Utkin Y.N., Kukhtina V.V., Maslennikov I.V., Eletsky A.V, Starkov V.G.,
Weise C., Franke P., Hucho F. and Tsetlin V.I. (2001) First tryptophan-containing
weak neurotoxin from cobra venom, Toxicon 39, 921-927.
-
(5) Kukhtina VV, Weise C, Muranova TA, Starkov VG, Franke P, Hucho F, Wnendt
S, Gillen C, Tsetlin VI, Utkin YuN (2000) Cobra Venom Contains Muscarinic
Toxins, Eur.J.Biochem. 267, 6784-6789.
-
(6) Dreger M, Otto H, Neubauer G, Mann M, Hucho F (1999) Identification
of phosphorylation sites in native lamina-associated polypeptide 2 beta.
Biochemistry 38, 9426-34.
-
(7) Watty, A., Weise, C., Dreger, M., Franke, P. and Hucho, F. (1998) The
Accessible Surface of the Nicotinic Acetylcholine Receptor - Identification
by Chemical Modification and Cross-Linking with 14C-dimethyl Suberimidate
Eur.J.Biochem. 252, 222-228.
-
(8) Mund, M., Weise, C., Franke, P. and Hucho, F. (1997) Mapping of Exposed
Surfaces of the Nicotinic Acetylcholine Receptor by Identification of Iodinated
Tyrosine Residues J.Prot.Chem. 16, 161-170.
-
(9) Machold, J., Weise, C., Utkin, Yu.U., Franke, P., Tsetlin, V.I. and
Hucho, F. (1995) A new class of photoactivatable and cleavable derivatives
of neurotoxin II from Naja naja oxiana. Synthesis, characterisation and
application for affinity labelling of the nicotinic acetylcholine receptor
from Torpedo californica Eur.J.Biochem. 228, 947-954.
-
(10) Rosenberger, U., Shakibaei, M., Weise, C., Franke, P. and Buchner,
K. (1995) Citric Acid Extracts a Specific Set of Proteins from Isolated
Cell Nuclei J.Cell.Biochem. 59, 177-185
-
(11) Strecker, A., Franke, P., Weise, C. and Hucho, F. (1994) All potential
glycosylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor subunit from
Torpedo californica are utilized, Eur.J.Biochem. 220, 1005-1011.
-
(12) Utkin, Yu.N., Weise, C., Tritscher, E., Machold, J., Franke, P., Tsetlin,
V.I. and Hucho, F. (1994) Isolation and structure determination of peptide
fragments from the cross-linked complex of lys26-p-azidobenzoyl neurotoxin
II from Naja naja oxiana with the nicotinic acetylcholine receptor from
Torpedo californica, Bioorganitscheskaja Kimiya 20, 1047-1060.
-
(13) Beckmann, R., Buchner, K., Jungblut, P., Eckerskorn, C., Weise, C.,
Hilbert, R. and Hucho, F. (1992) Nuclear Substrates of Protein Kinase C,
Eur. J. Biochem. 210, 45-51.
-
FU Berlin/ Universitätsklinikum Benjamin Franklin, Institut für
Molekularbiologie und Biochemie (AG Reutter)
-
FU Berlin/ Universitätsklinikum Benjamin Franklin, Institut für
Klinische Chemie und Pathobiochemie (AG Tauber)
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FU Berlin/ Institut für Biologie (Zoologie), Prof.Götz
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FU Berlin/ Institut für Biologie (Neurobiologie), P.Skiebe-Corette
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FU Berlin/ Institut für Biologie (Genetik), Prof. Kress
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FU Berlin/ Institut für Virologie, R.Stoyloff
-
Shemyakin and Ovchinnikov Institute for Bioorganic Chemistry, Moscow (AG
Tsetlin)
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Institute of Parasitology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Ceské
Budejovice, Czech Republic (P.Kopacek)
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Institut fuer Zellbiochemie und klinische Neurobiologie, Universität
Hamburg (H.-J.Kreienkamp)
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Institut für Neurobiologie Magdeburg (E.Gundelfinger)
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Laboratoire Oncogenese, Differenciation et Transduction du Signal, CNRS
UPR 9079, Institut Federatif André Lwoff, Villejuif (A. Harel-Bella,
EU-Projekt "Acetylon")
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INSERM U431, Universite de Montpellier 2 (B.Rouot)
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Deutsches Herzzentrum Berlin
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EMBL Heidelberg/ Prof.Hurt
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Robert-Koch-Institut Berlin/ Molekulare Immunologie (R.Kroczek)
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TU Berlin/ Max-Volmer-Institut (K.Irrgang)
u.v.a.m.