Thema:  AGRIN
Die Rolle von Agrin an der neuromuskulären Endplatte und im Zentralnervensystem
Gastreferent:  PD Dr.Stephan Kröger (MPI für Hirnforschung, Frankfurt/Main)

(Dr.Krögers Neuro-Vorlesungen sind auch im Internet abzurufen.)

Zusammenfassung:

Die Ausbildung von synaptischen Zellkontakten (Synaptogenese) erfordert eine räumlich und zeitlich koordinierte Spezialisierung der Plasmamembran der beteiligten Zellen. Die Mechanismen, die eine funktionelle synaptische Verschaltung hervorbringen, sind am Besten für die neuromuskuläre Endplatte, die Synapse zwischen Motoneuron und Muskelfaser, charakterisiert. Während der Synaptogenese bewegen sich die Wachstumskegel (growth cones) der Motoneuronaxone auf die Muskelfasern zu. Während der Kontaktaufnahme wird lokal die Bildung der Synapse induziert. Im Verlauf mehrerer Tage reift die neuromuskuläre Endplatte zu ihrer endgültigen Form. An ihren Rändern durch die glialen Schwann-Zellen begrenzt, etablieren sich präsynaptisch Cluster synaptischer Vesikel und eine effiziente regulierte Neurotransmitterausschüttung. Im synaptischen Spalt entsteht die synaptische Basalmembran. Postsynaptisch bilden sich Invaginationen der muskulären Plasmamembran (junctional folds), an deren Eingang der nikotinische Acetylcholinrezeptor aggregiert (receptor clustering) und an deren Ende spannungsabhängige Natriumkanäle in hoher Konzentration angeordnet sind. Unter der Synapse sammeln sich Myonuclei. Dort wird die Expression der Untereinheiten des nikotinischen Acetylrezeptors (nAChR) induziert, während sie in den extrasynaptischen Zellkernen unterdrückt wird. Außerdem wird die Gamma-Untereinheit des embryonalen Rezeptors durch die  Epsilon-Untereinheit des adulten Rezeptors ersetzt, der eine kürzere Öffnungszeit (open time) und eine erhöhte Leitfähigkeit aufweist und sich an der Synapse anreichert. Die extrasynaptischen, embryonalen Rezeptoren werden dagegen von der Plasmamembran der elektrisch aktiven Muskelfaser entfernt.
Während der Embryogenese entwickeln sich zunächst multiple Synapsen zwischen Motoneuronen und Muskelfasern, die im Laufe der weiteren Entwicklung zu einem Großteil eliminiert werden, bis im adulten Organismus genau eine neuromuskuläre Endplatte pro Muskelfaser existiert. Die Information über die Lage und Ausformung der Synapse ist dann in der synaptischen Basalmembran gespeichert. Regenerieren sich Muskelfaser und Motoneuron innerhalb einer intakten Muskelfaser-Basalmembran, wird der ursprüngliche synaptische Kontakt bis hin zu den morphologischen Details wiederhergestellt. Es wurde daher postuliert, daß in der synaptischen Basalmembran ein Agens existieren muß, das die synaptische Spezialisierung der beteiligten Zellen hervorruft. Ausgehend vom elektrischen Gewebe des Zitterrochens Torpedo californica, das in sehr hoher Dichte Synapsen enthält, die als Modell der neuromuskulären Endplatte aufgefasst werden können, wurde schließlich Agrin als dieses Agens identifiziert.
Agrin ist ein von vielen Zellen sezerniertes, ca. 200 kDa großes Protein. Es besitzt etliche Domänen, die aus anderen Proteinen der Basallamina bekannt sind, trägt einen hohen Anteil an Kohlehydratseitenketten und bildet den Proteinanteil eines Heparansulfat-Proteoglycans. Mit einer N-terminalen Domäne integriert es sich in die extrazelluläre Matrix. Durch alternatives Splicing ergeben sich verschiedene Isoformen, die durch kurze Inserts von Aminosäureresten an drei verschiedenen splice sites charakterisiert sind. Durch die Inserts der beiden C-terminalen splice sites (A/y, B/z) unterscheiden sich neuronale von nichtneuronalen Formen. Neuronale Agrin-Isoformen besitzen an der B/z-Site Inserts von 8, 11 oder 19 Aminosäureresten. Sie werden vom Motoneuron in den synaptischen Spalt sezerniert, wo sie die postsynaptische und möglicherweise auch, direkt oder indirekt, die präsynaptische Spezialisierung beeinflussen. Postsynaptisch bewirkt Agrin über einen noch nicht verstandenen Mechanismus die intrazelluläre Phosphorylierung der Proteintyrosinkinase MuSK (muscle-specific kinase), deren Aktivierung über ebenfalls noch nicht verstandene Mechanismen die Aggregation des Cytoskelettproteins Rapsyn und des nAChR hervorruft. Gleichzeitig wird die Beta-Untereinheit des nAChR durch src-ähnliche Tyrosinkinasen phosphoryliert. Agrin scheint ebenso die Differenzierung der Myonuclei und die Transkription der Epsilon-Untereinheit des Rezeptors zu  induzieren. Darin wird es möglicherweise durch neuronales Neuregulin unterstützt, das ebenfalls in die Basallamina inkorporiert wird und über muskuläre ErbB-Rezeptortyrosinkinasen auf die Muskelfaser wirkt.
Die Bildung von interneuronalen Synapsen im Zentralnervensystem ist vermutlich wesentlich komplexer reguliert als die Ausbildung der neuromuskulären Endplatte. Agrin ist auch dort in einigen Synapsen nachweisbar und ist möglicherweise auch im Zentralnervensystem an der Synaptogenese und der Plastizität ausgewählter synaptischer Kontakte beteiligt.
 

Figure 1: Agrin activation of MuSK leads to clustering  of synaptic proteins, including AChRs, rapsyn, ErbBs and muscle-derived NRG. Current data indicate that a myotube-specific activity(ies) is required for agrin to activate MuSK; this myotube-specific activity(ies) may be a co-ligand (shown here), co-receptor and/or post-translational modifications. Current experiments also suggest that a kinase(s) downstream of MuSK is also important for agrin-mediated signaling. (taken from the Burden Group homepage)

Weitere Information zu Agrin: http://srs.ebi.ac.uk/srs5bin/cgi-bin/wgetz?-e+[omim-id:103320]
 
 

Referat 1 (Sascha Rutz):
Jones et al. (1997), Proc.Natl.Acad.Sci. 94, 2654-2659
Induction  by agrin of ectopic and functional postsynaptic-like membrane in innervated muscle
Von Agrin und Neuregulin, zwei von den Nervenendigungen der Motoneuronen sezernierten Faktoren, wurde vermutet, dass sie die Lokalisation des nikotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) in der subsynaptischen Membran der Skelettmuskelfasern induzieren. Neuregulin sollte dabei die Expression der nAChR-Epsilon-Untereinheit, die charakteristisch für die neuromuskuläre Synapse des adulten Muskels ist, induzieren, Agrin die Aggregation der nAChR bewirken. Jones et al. zeigen jedoch, dass  Muskelfasern auch dort nAChR-Epsilon-Untereinheiten exprimieren, wo Myoblasten, in eine nervenfreie Region des denervierten Muskels injiziert, ausschließlich ein neuronales Agrin-Fragment sezernieren.
Die mRNA der Epsilon-Untereinheit und die exprimierten Untereinheiten selbst sind dort mit Agrin-Aggregaten und nAChR-Clustern, die resistent gegenüber elektrischer Muskelaktivität sind, kolokalisiert.
Einzelne innervierte Muskelfasern, in die intrazellulär Agrin-Expressionsplasmide im extrasynaptischen Bereich injiziert wurden, entwickeln an der Injektionsstelle Agrin-Aggregate und eine ektopische postsynaptische Membran mit Clustern von funktionsfähigen adulten nAChR, extrazellulär konzentrierter Acetylcholinesterase und, unter dieser ektopischen postsynaptischen Membran, einer Akkumulation von Myonuclei. Diese Ergebnisse zeigen, dass  Agrin alleine das neuronale Signal darstellen kann, das die Ausbildung des subsynaptischen Apparates in der Muskelfaser induziert und lokal, direkt oder indirekt, die Transkription der Gene der nAChR-Untereinheiten und die Aggregation des nAChR kontrolliert.
 
 

Referat 2 (Kathrin Emmerich):
Hering & Kröger, Dev. Biol. 214 (1999), 412-428
Synapse formation and agrin expression in stratospheroid cultures from embryonic chick retina
In dieser Arbeit wird eine spezielle Zellkulturtechnik beschrieben, die als Modell zentralnervöser Synapsenbildung dienen kann. Durch Proliferation und Differenzierung entwickeln sich aus neuroepthelialen Vorläuferzellen der Retina des Hühnerembryos unter rotierender Bewegung dreidimensionale Stratosphäroide, deren histotypische Schichtung der der späten embryonischen Retina sehr ähnlich ist. Die Synaptogenese, im inner plexiform layer immunologisch an der Expression synaptischer Proteine (Gephyrin, GABAA-, Glycin-Rezeptor) nachweisbar, ist der Entwicklung in vivo vergleichbar. Elektronenmikoskopisch zeigen sich morphologisch normale synaptische Kontakte.
Die Entstehung dieser zentralnervösen Synapsen  könnte auch durch Agrin beeinflusst werden, das in den Stratosphäroiden vergleichbar der Situation in der Retina exprimiert wird. Mittels RT-PCR wurde nachgewiesen, dass neben nicht-neuronalem Agrin zwei neuronale Isoformen exprimiert werden. Das Expressionsmuster und der zeitliche Verlauf der Expression ist wiederum der Situation in vivo sehr ähnlich. Während das nicht-neuronale Agrin sehr früh exprimiert wird und mit verschiedenen Strukturen, beispielsweise den Müller-Gliazellen, assoziiert, ist neuronales Agrin erst während der Synaptogenese nachweisbar und dann ausschließlich im inner plexiform layer und synaptisch lokalisiert.
 

Seite erstellt von Chris Weise, Juni 2000